Nuevas herramientas para ver lo imperceptible

El uso de “redes neuronales artificiales” en microscopía facilita el análisis masivo
de datos provenientes de bioimágenes, reduce tiempos de labor minuciosa, garantiza altos niveles de precisión y permite su reproducibilidad y cuantificación.

| Comentario de Haydee O. Hernández Aviña, Mónica Ramírez Vázquez, José Fabián Villa Manríquez y Paúl Hernández Herrera

La microscopía es una disciplina que nace de la curiosidad por ver lo que no es perceptible a simple vista. Desde su aparición en los siglos XVI y XVII ha traído múltiples beneficios a la humanidad: con sus distintas técnicas ha sido posible estudiar y conocer a la célula (unidad fundamental de todo ser vivo), describir sus procesos y adentrarnos en sus secretos más íntimos; sentando, así, las bases para lo que sería la “teoría celular” de Theodor Schleiden y Matthias Schwann en el siglo XIX.

Con el paso del tiempo surgieron nuevas preguntas que condujeron a los científicos a desarrollar nuevas combinaciones de lentes y a mejorar las técnicas y fuentes de iluminación, derivando así a la microscopía óptica avanzada. En este grupo podemos encontrar a la microscopía de fluorescencia y la confocal, ambas basadas en el mismo principio: el uso de la fluorescencia, propiedad de ciertas moléculas que pueden absorber y emitir luz.

La microscopía confocal surgió como una herramienta para visualizar eventos celulares experimentales, lo que permite estudiar de manera sistemática múltiples aspectos estructurales y funcionales de las proteínas en las células vivas. Al ser una técnica no invasiva, resulta muy útil para obtener una o múltiples imágenes que contengan la información del grosor de todo el tejido con una alta resolución espacial.

Precisión microscópica

Actualmente, para el estudio de sistemas biológicos se busca simular las condiciones adecuadas para observar a los organismos vivos (células, bacterias, plantas, etcétera), debido a que las interacciones, en el ambiente y el mecanismo de observación, pueden variar los resultados de las pruebas. Es por ello que los microscopios han sido mejorados para adquirir una gran cantidad de imágenes en poco tiempo sin dañar la muestra. Asimismo, se han desarrollado diferentes equipos para la adquisición de imágenes en 3D (tres dimensiones: altura, anchura y profundidad) y 3D más la componente del tiempo.

Cabe señalar que para generar una imagen en 3d es necesario capturar una imagen en 2d a distintas distancias focales para su posterior reconstrucción tridimensional (Figura 1). En el caso de un estudio de lapso de tiempo, se realiza esta misma acción en múltiples ocasiones para tener una imagen 3d para cada tiempo de observación. Al final de este proceso se han generado cientos de imágenes, de las cuales se realizan mediciones cuantitativas o cualitativas como determinar y discriminar diferentes aspectos: grosor de la muestra, presencia de proteínas, fluorescencia natural de otras moléculas, entre otros.

En la última década, las áreas biológicas y de la salud han buscado tener mediciones más rigurosas, menos subjetivas, con el uso del procesamiento de imágenes y estadística, sobre todo para reproducir los resultados.

Automatismo y simplificación

La Inteligencia Artificial (IA) es una rama de las ciencias de la computación que busca realizar tareas de manera automatizada, aprendiendo los patrones que realizaría un experto.

Existen muchos ejemplos de aplicaciones de IA, como los juegos (una máquina capaz de jugar ajedrez de manera inteligente), el diagnóstico de enfermedades (una herramienta computacional diseñada para la detección de cáncer en mamografías), los “sistemas inteligentes” (el funcionamiento de diversos aparatos mediante “comandos de voz”) y, recientemente, el desarrollo de vehículos autónomos, entre muchos otros.

El aprendizaje automático es una subárea de la IA que se encarga de hacer que la computadora aprenda o mejore su desempño mediante observaciones de la tarea por replicar.

En microscopía, así como en otras disciplinas, la IA ha adquirido gran popularidad debido a la simplificación de tareas. Se han diseñado metodologías capaces de analizar miles de imágenes en unos segundos con resultados similares o mejores a los obtenidos por un humano experto.

En las imágenes de microscopía —en las que se requiere delinear núcleos, detectar bacterias o patrones en las imágenes, hacer cuantificaciones, etcétera—, normalmente es necesario realizar la misma tarea de manera repetitiva, lo cual puede ser tedioso, requerir de una cantidad considerable de tiempo y ser propenso a errores humanos debido al cansancio. La IA y el aprendizaje automático están desarrollados, especialmente, para resolver este tipo de situaciones.

El aprendizaje automático es una subárea de la IA que se encarga de hacer que la computadora aprenda o mejore su desempeño mediante observaciones de la tarea por replicar; observaciones que corresponden al dato de entrada y el resultado esperado. Por ejemplo: 1) Imagen 2D confocal de una raíz y núcleos delineados manualmente por el experto, y 2) Mamografía y su respectivo diagnóstico, etc. Dependiendo de la complejidad de la tarea por replicar se pueden requerir pocas observaciones para problemas sencillos: ocho observaciones para la detección de núcleos; miles de observaciones para problemas difíciles (10 mil para generar una imagen de superresolución) o, incluso, millones para problemas complejos (1.2 millones para identificar objetos en imágenes).

Un algoritmo popular de aprendizaje automático es la “red neuronal artificial”, inspirada en la forma en que se transmite la información en el cerebro. Los nodos, una de las partes principales de la red, tratan de emular el comportamiento de una neurona. Cada nodo de la red neuronal artificial recibe datos de entrada, los combina y produce nuevos datos, de manera similar a una neurona que recibe impulsos eléctricos en las dendritas, los combina en el soma y produce nuevos impulsos en el axón. Estos nodos se organizan en capas: los datos de entrada se procesan en la primera capa de nodos (usualmente, miles de nodos por capa) y producen nuevos datos, mismos que se procesan en una segunda capa de nodos y así, sucesivamente, hasta llegar a una capa final donde se obtiene el resultado esperado. Entre más capas (profundidad) tenga la red, puede aprender relaciones más complejas de los datos y, por lo tanto, resolver problemas más difíciles (Figura 2).

Velocidad y superresolución

En microscopía, la IA ha permitido analizar una cantidad enorme de datos que eran intratables de manera manual. Ejemplo de ello es la delineación de núcleos en imágenes, un problema muy común en microscopía: las redes neuronales artificiales han permitido delinear en menos de un segundo más de mil núcleos en una imagen; esta tarea, realizada por un humano experto, puede tomar hasta tres horas de labor continua.

Otro caso es el de la microscopía de superresolución, que permite observar objetos a resoluciones de nanómetros, pero que requiere de técnicas complejas y, usualmente, equipo muy costoso y poco accesible para la mayoría de los laboratorios. Para resolver esto se han desarrollado técnicas basadas en ia que permiten observar objetos a la escala de nanómetros utilizando microscopios convencionales, así como otras aplicaciones comunes como remover ruido en imágenes, detectar eventos de división de núcleos, seguimiento de partículas, etcétera (Figura 3).

Además de la posibilidad de analizar una cantidad enorme de datos en poco tiempo, la IA ofrece otras ventajas: la reproducibilidad de los resultados, pues un modelo de red neuronal siempre obtendrá el mismo resultado, así como la alta fidelidad de los resultados obtenidos, incluso superando a un humano experto.

Pueden existir desventajas que limiten el uso de algoritmos de aprendizaje automático como las redes neuronales. Entre las principales: la necesidad de entrenamiento especializado, el cual puede requerir muchas horas/semanas, incluso meses, de labor

Sin embargo, también pueden existir desventajas que limiten el uso de algoritmos de aprendizaje automático como las redes neuronales. Entre las principales: la necesidad de entrenamiento especializado, el cual puede requerir muchas horas/semanas, incluso meses, de labor; asimismo, son necesarios conocimientos profundos en matemáticas y ciencias de la computación para obtener una capacitación adecuada que produzca resultados superiores al humano; por último, el entrenamiento rápido exige el acceso a computadoras con alta capacidad de procesamiento (GPU).

Por fortuna, existen proyectos internacionales que tienen como fin aliviar algunas de estas desventajas, como ZeroCostDL4Mic, DeepImageJ y MIA, además de organizaciones como la Iniciativa Chan Zuckerberg, cuyo propósito es facilitar el uso y acceso a las nuevas herramientas para la comunidad de microscopistas.

Finalmente, algo que debe tomarse en cuenta respecto a los algoritmos de aprendizaje automático supervisado es que su desempeño depende, en buena medida, de la calidad de las observaciones proporcionadas a la IA. Es decir, que si las observaciones tienen un sesgo, es factible que la aplicación aprenda ese sesgo. Por ejemplo, en la detección de núcleos: si las observaciones proporcionadas son solamente de núcleos pequeños, es muy probable que la IA tendrá problemas para detectar núcleos grandes. Por esta razón es muy importante proporcionar observaciones parecidas a la tarea que deba realizarse.


BIBLIOGRAFÍA

Ahangar, M. N. et al. (2021). “A Survey of Autonomous Vehicles: Enabling Communication Technologies and Challenges”, en Sensors, 21(3), 706.

Barbier de Reuille, P. et al. (2015). “MorphoGraphX: A Platform for Quantifying Morphogenesis in 4d”, en eLife 4:e05864.

Campbell, M. et al. (2002). “Deep Blue”, en Artificial Intelligence, 134(1-2), 57-83.

Chen, R. et al. (2021). “Deep-Learning Super-Resolution Microscopy Reveals Nanometer-Scale Intracellular Dynamics at The Millisecond Temporal Resolution”, en bioRxiv.

Dardikman-Yoffe, G. y Y. C. Eldar (2020). “Learned Sparcom: Unfolded Deep Super-Resolution Microscopy”, en Optics Express, 28(19), 27736.

Gómez-de-Mariscal, E. et al. (2021). “DeepImageJ: ‘A User-Friendly Environment to Run Deep Learning Models in Image’”, en J. Nat Methods 18, 1192–1195. Disponible en http://bit.ly/3AmYnEG (Consultado el 3 de noviembre de 2022).

Körber, N. (2022). “mia: An Open-Source Standalone Deep Learning Application for Microscopic Image Analysis”, en bioRxiv, 2022.01.14.476308.

Krizhevsky B.A et al. (2012). “Imagenet Classification with Deep Convolutional Neural Networks”, en Adv. Neural Inf. Process. Syst.25.

León-Rodríguez, S.G. et al. (2022). “A Machine Learning Workflow of Multiplexed Immunofluorescence Images to Interrogate Activator and Tolerogenic Profiles of Conventional Type 1 Dendritic Cells Infiltrating Melanomas of Disease-Free and Metastatic Patients”, en Journal of Oncology, vol. 2022.

Liu, Z. et al. (2021). “A Survey on Applications of Deep Learning in Microscopy Image Analysis”, en Computers in Biology and Medicine, 134.

López-Macay, A. et al. (2016). “Principios y aplicaciones de la microscopía láser confocal en la investigación biomédica”, en Investigación en Discapacidad, 5(3), 156-164.

Mariné, M. H. et al. (2004). “Microscopy Methods Applied to Research on Cyanobacteria”, en Limnetica, 23(1-2), 179-186.

McKinney, S. M. et al. (2020). “International Evaluation of an ai System for Breast Cancer Screening”, en Nature, 577(7788), 89-94.

Neu, T. R. et al. (2004). “Three-Dimensional of Photo-Autotrophic Biofilm Constituents by Multi-Channel Laser Scanning Microscopy (Single-Photon and Two-Photon Excitation)”, en J Microbiol Methods, 56:161-172.

Quercioli F. (2011). “Fundamentals of Optical Microscopy”, en A. Diaspro, ed., Optical Fluorescence Microscopy. Disponible en https://bit.ly/3T4sBTo (Consultado el 3 de noviembre de 2022).

Ramírez, M. et al. (2010). “Cyanobacteria-Containing Biofilms from a Mayan Monument in Palenque, Mexico”, en Biofouling, 26:399-409

Ramírez, M. et al. (2011). “Polyphasic Approach and Adaptative Strategies of Nostoc cf. commune (Nostocales, Nostocaceae) Growing on Mayan monuments”. Fottea, 11(1), 73-86.

Ribatti, Domenico (2018). “An Historical Note on The Cell Theory”, en Experimental Cell Research. 364(1):1-4. Disponible en https://bit.ly/3sYo4Hx (Consultado el 3 de noviembre de 2022).

Shaner, N. C. et al. (2007). “Advances in Fluorescent Protein Technology”, en Journal of Cell Science, 120(24), 4247-4260.

Torres-García E. et al. (2021). “Nanoscopic Resolution within a Single Imaging Frame”, en bioRxiv. Disponible en https://bit.ly/3zHDPpS (Consultado el 3 de noviembre de 2022).

Vasil, I.K. (2008). “A History of Plant Biotechnology: From the Cell Theory of Schleiden and Schwann to Biotech Crops”, en Plant Cell Rep 27, 1423–1440. Disponible en https://bit.ly/3sYAU8Q (Consultado el 3 de noviembre de 2022).

Von Chamier, et al. (2021). “Democratising Deep Learning for Microscopy with ZeroCostDL4Mic”, en Nature communications, 12(1), pp. 1-18.

Von Chamier, L. et al. (2019). “Artificial Intelligence for Microscopy: What you Should Know”, en Biochemical Society Transactions, 47(4), 1029-1040.

Webb, S. (2018). “Deep Learning for Biology”, en Nature, 554(7690), 555-558.


PIES DE FOTO:

Figura 1

a) Obtención de múltiples imágenes 2D para su posterior reconstrucción tridimensional (profundidad) por microscopía de fluorescencia o confocal.

b) Reconstrucción 3D a partir de serie de imágenes (máxima proyección).

c) Obtención de datos, procesamiento de la imagen y análisis.

Figura 2 

Algunas aplicaciones de DeepImageJ (Tomado de Gómez-de-Mariscal et al.).

Figura 3

Aplicaciones de la IA en el aprendizaje profundo para microscopía.

a) Segmentación de células (raíz Arabidopsis Thaliana): líneas transgénicas con marcadores de núcleo y membrana plasmática fueron seleccionados y un microscopio confocal de disco giratorio adquirió imágenes 3d de la raíz, algoritmos de IA (MorphographX) fueron utilizados para segmentar cada célula (identificadas con diferente color).

b) Segmentación de núcleos (tejido de muestras de melanoma): núcleos fueron marcados con Hoechst y adquiridos con microscopía confocal (imagen 2d). Cada núcleo (identificado con colores diferentes) fue automáticamente detectado utilizando un algoritmo de IA.

c) Superresolución de cianobacteria (Nostoc cf. commune). Imágenes 2d de autofluorescencia adquirida por microscopía confocal aplicando el algoritmo MSSR. Se alcanzan escalas nanométricas, se puede diferenciar a la clorofila (verde) y las ficobiliproteínas (rojo).

icono-13junio

Haydee O. Hernández, Mónica Ramírez, José F. Villa y Paúl Hernández

Posgrado en Ciencia e Ingeniería de la Computación | Facultad de Ciencias | Instituto de Ciencias Aplicadas | Tecnología y Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada, UNAM
Search
Escucha el contenido

Descarga el número completo en versión PDF. Puedes leerlo en tus dispositivos o imprimirlo bajo demanda.
¡Forma tu colección!

SÍGUENOS